根据目标(总丰度 vs. 特定类群丰度)和精度要求，可选择不同方法。

　　(一)总微生物丰度检测

　　磷脂脂肪酸分析 (PLFA - Phospholipid Fatty Acid Analysis)

　　原理：磷脂是活体微生物细胞膜的主要成分，且不同类群微生物(细菌、真菌、G⁺、G⁻、放线菌等)有特征性的PLFA谱。

　　丰度表示：通过气相色谱-质谱(GC-MS)测定总PLFA含量(nmol/g 干土)，可近似反映总活体微生物生物量。特定PLFA的含量可代表特定类群的生物量。

　　优点：

　　反映活体微生物(死亡细胞的磷脂会迅速降解)。

　　可同时获得群落结构信息(分类学)。

　　缺点：成本较高，操作复杂，不能精确到物种水平。

　　直接显微镜计数法 (Direct Microscopic Count)

　　原理：用荧光染料(如DAPI、Acridine Orange)染色土壤提取液中的微生物细胞，在荧光显微镜下直接计数。

　　丰度表示：细胞数/g 干土。

　　优点：直接、快速，可观察细胞形态。

　　缺点：

　　无法区分死/活细胞。

　　土壤颗粒和腐殖质干扰大，背景荧光强，计数困难。

　　不能区分微生物类群。

　　精度较低，代表性差。

　　总DNA浓度测定

　　原理：提取土壤总DNA，用分光光度计(A260)或荧光计(如Qubit, PicoGreen)测定DNA浓度。

　　丰度表示：ng DNA / g 干土。

　　优点：操作相对简单，高通量。

　　缺点：

　　包含死细胞、游离DNA和病毒DNA，高估活体微生物量。

　　不同微生物的基因组大小差异大，相同DNA量不代表相同细胞数。

　　仅提供总核酸量，无分类信息。

　　(二)特定微生物类群丰度检测

　　实时荧光定量PCR (qPCR - Quantitative PCR)

　　原理：使用针对特定微生物类群(如总细菌16S rRNA基因、总真菌ITS、氨氧化菌amoA基因、固氮菌nifH基因、病原菌特异性基因等)的引物和探针，通过荧光信号积累的循环阈值(Ct值)来定量目标基因的拷贝数。

　　丰度表示：目标基因拷贝数 / g 干土(常取对数log₁₀)。

　　优点：

　　高灵敏度、高特异性、高通量。

　　可绝对定量(需标准曲线)。

　　是研究功能微生物丰度的金标准。

　　缺点：

　　需预先知道目标基因序列。

　　受PCR抑制物(腐殖酸)影响，需优化提取和扩增。

　　基因拷贝数 ≠ 细胞数(不同物种基因组拷贝数不同)。

　　高通量测序数据中的相对丰度 (Relative Abundance)

　　原理：在16S rRNA基因或ITS扩增子测序数据中，某个OTU(可操作分类单元)或ASV(扩增子序列变体)的序列数占该样品总序列数的比例。

　　丰度表示：百分比(%)。

　　优点：可在一次测序中获得成百上千个分类单元的相对丰度，全面了解群落结构。

　　重要局限：

　　这是相对丰度，不是绝对丰度。一个类群比例升高，可能是因为它增多了，也可能是因为其他类群减少了。

　　不能直接比较不同样品间的绝对数量。

　　数字PCR (dPCR - Digital PCR)

　　原理：将PCR反应分配到数万个微反应单元中，终点直接计数阳性/阴性单元，实现绝对定量，无需标准曲线。

　　丰度表示：目标基因拷贝数 / g 干土。

　　优点：

　　绝对定量，抗PCR抑制物能力强。

　　精度和准确度高于qPCR，尤其适用于低丰度目标。

　　缺点：成本高，通量相对较低。

       来源：网络