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间接免疫荧光试验(Indirect Immunofluorescence Assay, IIFA)是一种广泛应用于检测和定量分析样本中特定抗原或抗体的技术。当用于测量病毒滴度时,主要是通过观察病毒感染细胞后产生的特异性反应来实现的。这种方法可以用来确定病毒的感染性滴度,即每单位体积中能够引起感染的病毒颗粒数量。
间接免疫荧光测病毒滴度的基本步骤:
准备细胞:选择适合被研究病毒生长的细胞系,并将其培养至适当的密度。
病毒感染:将不同稀释度的病毒悬液加入到单层细胞中,通常使用多孔板进行操作以便同时处理多个样品和控制组。之后,在适宜条件下孵育足够时间以允许病毒吸附并进入细胞内复制。
固定与透化处理:感染完成后,需要对细胞进行固定(如使用甲醇或丙酮)和可能的透化处理(如使用Triton X-100),这样可以使细胞保持结构完整性的同时让抗体能够穿透细胞膜识别内部的病毒抗原。
第一抗体孵育:向已固定的细胞层上添加针对目标病毒抗原的特异性初级抗体,并在适宜温度下孵育一段时间,使抗体与病毒抗原结合。
洗涤:去除未结合的第一抗体,减少背景信号。
第二抗体孵育:加入标记有荧光染料(如FITC、TRITC等)的第二抗体,该抗体能够识别并结合第一抗体。再次孵育后,清洗掉多余的第二抗体。
观察与分析:使用荧光显微镜观察细胞层,计数显示出荧光信号的细胞数目。根据所使用的病毒稀释度和显示阳性荧光的细胞比例,计算出病毒滴度。
结果解释:通过比较不同稀释度下的阳性细胞率,可以确定导致50%细胞感染的病毒稀释度,从而计算出病毒滴度,通常用TCID50(50% Tissue Culture Infective Dose)表示。
这种方法不仅适用于实验室环境中对病毒的研究,也常用于临床诊断中快速检测某些特定病原体的存在与否及其活性水平。然而,值得注意的是,尽管IIFA提供了直观且相对简便的操作流程,但其敏感性和特异性依赖于所用抗体的质量以及实验条件的优化。
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