土壤微生物种类和数量的检测是研究土壤健康、肥力、生态功能及环境修复的核心内容。土壤微生物群落极为复杂，包括细菌、真菌、放线菌、古菌、原生动物、藻类和病毒等。随着技术发展，检测方法从传统的培养法逐步发展为现代分子生物学和高通量测序技术。

　　下面是土壤微生物**种类(多样性)和数量(丰度)**检测的主要方法，按技术类型分类：

　　一、传统培养法(Culture-Dependent Methods)

　　适用于可培养微生物的数量测定，但仅能检测约 1–5% 的土壤微生物(多数不可培养)。

　　1. 稀释平板计数法(Dilution Plate Count)

　　原理：将土壤样品梯度稀释后涂布于选择性或非选择性培养基上，培养后计数菌落数(CFU, Colony Forming Units)。

　　应用：

　　细菌：牛肉膏蛋白胨培养基(Nutrient Agar)，37°C，24–48h。

　　真菌：马丁氏培养基(Martin's Medium)+ 链霉素，28°C，3–7d。

　　放线菌：高氏一号培养基(Gauze's Medium)，28–30°C，7–10d。

　　优点：操作简单、成本低、可获得活菌信息。

　　缺点：

　　覆盖率低(多数微生物不可培养)。

　　结果受培养基选择性和培养条件影响大。

　　无法准确反映真实群落结构。

　　2. z大概率数法(MPN, Most Probable Number)

　　原理：基于统计学，通过系列稀释液在液体培养基中的生长情况(如产气、变色)估算微生物数量。

　　应用：常用于功能微生物计数，如固氮菌、硝化菌、纤维素分解菌等。

　　优点：适用于低丰度或特定功能菌群。

　　缺点：耗时长，精度较低。

　　二、显微镜直接计数法(Direct Microscopic Count)

　　可测定总微生物数量，但无法区分种类。

　　1. 染色-显微镜计数

　　方法：

　　使用 DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或 Acridine Orange(吖啶橙)对土壤提取液中的微生物细胞进行荧光染色。

　　在荧光显微镜下计数。

　　优点：

　　可检测所有微生物(包括不可培养种)。

　　快速获得总生物量。

　　缺点：

　　无法区分种类。

　　易受土壤颗粒干扰，需前处理(如离心、浮选)。

　　不能区分死/活细胞(除非用活体染料如SYTO 9/PI)。

　　三、现代分子生物学方法(Culture-Independent Methods)

　　目前主流技术，可全面解析微生物种类多样性和相对/绝对丰度。

　　1. DNA提取

　　关键步骤：从土壤中高效提取高质量微生物总DNA。

　　注意：土壤中腐殖酸等抑制物需去除(使用商业试剂盒如MoBio PowerSoil Kit)。

　　2. PCR扩增与电泳分析

　　(1)变性梯度凝胶电泳(DGGE) / 温度梯度凝胶电泳(TGGE)

　　原理：基于PCR扩增的16S rRNA(细菌/古菌)或ITS(真菌)基因片段，在变性梯度凝胶中因序列不同而分离成不同条带。

　　优点：可视化群落结构变化。

　　缺点：分辨率有限，条带难鉴定，半定量。

　　(2)末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)

　　原理：PCR产物用限制性内切酶消化，不同片段长度在毛细管电泳中分离。

　　优点：可量化不同类群的相对丰度。

　　缺点：需标准数据库匹配，信息量有限。

　　3. 高通量测序(High-Throughput Sequencing) —— 当前金标准

　　(1)扩增子测序(Amplicon Sequencing)

　　目标基因：

　　细菌/古菌：16S rRNA 基因(V3-V4区常用)

　　真菌：ITS 区(ITS1或ITS2)

　　放线菌：特异性引物扩增

　　平台：Illumina MiSeq, NovaSeq(主流);PacBio(长读长)

　　流程：

　　DNA提取

　　PCR扩增目标基因(加接头和条形码)

　　文库构建与质检

　　高通量测序

　　生物信息学分析(如QIIME2, Mothur, USEARCH)

　　输出结果：

　　种类(α多样性)：OTUs(操作分类单元)或ASVs(扩增子序列变体)、Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数。

　　种类(β多样性)：PCoA、NMDS分析群落结构差异。

　　物种注释：属、种水平分类(基于Greengenes, SILVA, UNITE数据库)。

　　相对丰度：各类群在群落中的占比。

　　优点：

　　覆盖度高，可检测不可培养微生物。

　　高分辨率，可到属甚至种水平。

　　适用于大规模样本比较。

　　缺点：

　　成本较高。

　　为相对丰度，不直接反映绝对数量。

　　PCR扩增存在偏好性。

　　(2)宏基因组测序(Metagenomic Sequencing)

　　原理：对土壤总DNA进行全基因组测序(无需PCR扩增)。

　　优点：

　　可获得全部基因信息，不仅能鉴定物种，还能分析功能基因(如氮循环、碳循环、抗生素抗性基因)。

　　避免PCR偏差。

　　缺点：

　　成本更高，数据量巨大，分析复杂。

　　对低丰度物种检测灵敏度低于扩增子测序。

　　4. 定量PCR(qPCR, Real-Time PCR)

　　目的：绝对定量特定微生物类群或功能基因的拷贝数。

　　原理：使用特异性引物和荧光探针(如TaqMan)，通过Ct值与标准曲线计算目标基因数量。

　　应用：

　　细菌16S rRNA基因总量

　　真菌ITS拷贝数

　　功能基因：nifH(固氮)、amoA(氨氧化)、nosZ(反硝化)、16S rRNA(总细菌)

　　单位：拷贝数/g干土

　　优点：灵敏度高、定量准确。

　　缺点：一次只能检测一个或少数几个目标，无法全面评估多样性。

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