土壤是地球上z丰富的微生物栖息地之一，每克土壤中可含有 10⁸–10¹⁰ 个细菌。准确测定土壤细菌总数对于评估土壤健康、肥力、生态功能及环境污染修复具有重要意义。

　　常用测定方法详解

　　1. 平板菌落计数法(Standard Plate Count, SPC)

　　原理：

　　将土壤样品稀释后涂布或倾注于固体培养基，培养后计数形成的菌落单位(CFU, Colony Forming Units)。

　　操作步骤：

　　样品制备：

　　称取10 g新鲜土壤，加入90 mL无菌生理盐水(0.85% NaCl)

　　振荡30分钟，静置1分钟，制成10⁻¹原液

　　梯度稀释：

　　用无菌水或生理盐水进行10倍系列稀释(10⁻³–10⁻⁷)

　　接种：

　　涂布法：取0.1 mL稀释液涂布于琼脂平板

　　倾注法：取1 mL稀释液与熔化的琼脂混合

　　培养：

　　常用培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂、R2A琼脂(适合寡营养菌)

　　培养条件：28–30°C，培养24–72小时

　　计数：

　　选择菌落数在30–300之间的平板

　　计算公式：

      例如：10⁻⁶稀释度，0.1 mL接种，平均菌落数150 → $150\times 10^6\times 10=1.5\times 10^9\text{CFU/g}$

　　优点：

　　操作简单，成本低

　　可获得活菌数量

　　缺点：

　　仅能检测可培养细菌(<5%)

　　培养基和条件影响结果

　　忽略休眠或难培养菌

　　2. z大可能数法(MPN法, Most Probable Number)

　　适用场景：

　　细菌数量较少或需测定特定功能菌群(如固氮菌、硝化菌)

　　方法：

　　将样品进行系列稀释，每个稀释度接种多管液体培养基

　　根据阳性管数查MPN表估算细菌数量

　　优点：

　　适合低丰度菌群

　　可结合功能鉴定

　　缺点：

　　精度较低

　　耗时长

　　3. 显微镜直接计数法(Acridine Orange 或 DAPI 染色)

　　原理：

　　使用荧光染料(如DAPI、Acridine Orange)染色所有细菌细胞，通过荧光显微镜直接计数。

　　操作步骤：

　　样品处理：

　　取0.5 g土壤 + 5 mL无菌水，超声分散1分钟

　　离心去除大颗粒，取上清

　　过滤：

　　将悬浮液通过0.22 μm滤膜过滤

　　染色：

　　在滤膜上滴加DAPI(1 μg/mL)，避光染色10分钟

　　洗涤与观察：

　　用无菌水轻洗，置于载玻片上

　　荧光显微镜下(激发波长360 nm)观察蓝色荧光细胞

　　计数：

　　随机选取多个视野，统计细胞数

　　换算为每克土壤细菌数

　　优点：

　　检测全部细菌(包括不可培养)

　　快速、直观

　　缺点：

　　无法区分死/活细胞(除非用活死染色)

　　操作要求高，易受杂质干扰

　　需荧光显微镜

　　4. qPCR法(定量PCR)

　　原理：

　　通过扩增细菌16S rRNA基因的保守区域，利用标准曲线定量总细菌基因拷贝数。

　　操作流程：

　　DNA提取：

　　使用土壤DNA提取试剂盒(如MoBio PowerSoil Kit)

　　qPCR扩增：

　　引物：通用细菌引物(如338F: 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，806R: 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')

　　体系：SYBR Green或TaqMan探针

　　标准曲线构建：

　　用已知浓度的质粒DNA制作标准曲线

　　计算：

　　根据Ct值计算每克土壤中16S rRNA基因拷贝数 → 换算为细菌数量(假设平均每个细菌含4–5个16S拷贝)

　　优点：

　　灵敏度高(可检测低至10²细胞/g)

　　特异性强，定量准确

　　可自动化

　　缺点：

　　成本高

　　DNA提取效率影响结果

　　无法区分活/死细胞(除非结合PMA处理)

　　5. 高通量测序辅助定量

　　虽主要用于群落结构分析，但结合内标(spike-in)或qPCR数据，可实现相对或绝对定量。

　　常用于研究细菌多样性与丰度变化。

       来源：网络