土壤 β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, EC 3.2.1.21)是参与碳循环的关键水解酶之一，能催化纤维素降解的z后一步——将纤维二糖水解为葡萄糖，从而释放植物可利用的碳源。其活性反映土壤微生物对有机碳的矿化能力，常用于评估土壤肥力、有机质分解速率、污染胁迫响应及生态恢复效果。

　　常用测定方法详解(以对硝基苯酚比色法为例)

　　下面是基于经典方法的标准化步骤。

　　实验准备

　　主要试剂：

　　底物溶液：0.05 M 对硝基苯基-β-D-葡糖苷(PNG)溶液(用pH合适的缓冲液配制)。

　　缓冲液：常用醋酸盐缓冲液(pH 5.0-5.5) 或通用缓冲液(如Modified Universal Buffer，可调节至不同pH)，以模拟土壤微环境的酸性条件。

　　终止/显色剂：0.5 M 氢氧化钙(Ca(OH)₂) 或0.1 M Tris-HCl缓冲液(pH 12)。用于终止反应并创造碱性环境使PNP显色。

　　标准溶液：准确浓度的对硝基苯酚(PNP)标准溶液，用于制作标准曲线。

　　仪器：恒温培养箱/水浴摇床、离心机、分光光度计、振荡器、分析天平、计时器、离心管/试管等。

　　实验步骤

　　通常设置样品组、对照组和标准曲线组。

　　称样：准确称取1.00 g过筛(如2 mm)的新鲜或冷冻干燥土壤样品，置于50 mL离心管或三角瓶中。

　　使用鲜土：结果更能反映田间实际活性，但需尽快测定。

　　使用冻干土：稳定性好，便于长期比较，但可能部分改变酶活性。

　　加试剂：

　　样品管(T)：加入4 mL缓冲液 + 1 mL PNG底物溶液。

　　对照管(C)：加入4 mL缓冲液 + 1 mL 相同缓冲液(不加底物!)。用于扣除土壤本身颜色和可能释放的干扰物质。

　　立即设置一个“零时间对照”(C0)：在样品中加入缓冲液后，先加终止剂，再加底物。这是严谨的做法，用于校正非酶促水解。

　　培养反应：

　　将所有管子盖紧，放入37°C恒温振荡培养箱中，避光振荡培养1-2小时。

　　时间需预实验确定，确保反应在线性期内(PNP生成量与时间成正比)。

　　终止反应与显色：

　　培养结束后，立即向所有管中加入4 mL冰冷的0.5 M Ca(OH)₂溶液(或1 mL Tris-HCl pH 12)，迅速摇匀以终止酶反应。

　　向对照管(C) 中补加1 mL PNG底物溶液(确保所有管成分一致，仅反应时间不同)。

　　离心与过滤：将反应液在4°C、4000 rpm下离心10分钟，或通过滤纸/膜过滤，获取清澈上清液。

　　比色测定：用分光光度计在410 nm波长下，以蒸馏水或对照管上清液调零，测定样品管上清液的吸光度值。

　　绘制标准曲线：

　　用PNP标准溶液配制一系列浓度梯度(如0、5、10、20、30、40 μg/mL)。

　　取与样品等体积(如1 mL)的标准液，加入相同体积的终止剂和缓冲液，直接测定410 nm吸光度。

　　绘制PNP浓度(μg/mL)- 吸光度标准曲线，得到线性回归方程。

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