土壤脱氢酶(Dehydrogenase, DHA)是反映土壤微生物代谢活性的关键酶，广泛用于评估土壤生物活性、有机污染毒性、施肥效应及生态系统健康状况。该酶催化有机物脱氢反应，将电子传递给人工电子受体(如 TTC)，生成可定量的红色产物(三苯基甲臜，TPF)，其活性与活微生物量高度相关。

　　1. 试剂与仪器

　　主要试剂：

　　Tris-HCl缓冲液：提供稳定pH环境(通常pH 7.4-7.6)。

　　TTC溶液：用上述缓冲液新鲜配制(常用浓度0.5%-1%)。

　　有机溶剂：甲醇或丙酮，用于终止反应和提取TF。甲醇更常用，毒性相对较低，提取效率高。

　　葡萄糖溶液(可选)：作为外源底物，可刺激微生物活性，测得潜在脱氢酶活性;不加则测得固有脱氢酶活性。

　　三苯甲标准品：用于绘制标准曲线。

　　主要仪器：恒温培养箱、振荡器、离心机、分光光度计、分析天平。

　　2. 关键步骤详解

　　① 土样准备：

　　使用新鲜土壤(风干会杀死微生物)，剔除可见植物残体，过2mm筛。

　　调节土壤含水量至田间持水量的40%-60%，预培养1-7天以稳定微生物状态。

　　② 实验设置(必须做三组!)：

　　样品组：土壤 + TTC溶液 + 缓冲液(±底物)。

　　灭活对照组：土壤 + TTC溶液 + 缓冲液，但土壤事先经高压灭菌或加入有毒试剂(如甲苯) 灭活微生物。用于扣除土壤本底(如某些矿物质)对TTC的非生物还原。

　　无基质对照组：土壤 + 缓冲液(无TTC)。用于校正土壤有色物质的干扰。

　　③ 孵育反应：

　　将上述混合物在37°C恒温、避光条件下孵育24小时。避光至关重要，因为TTC见光会分解。

　　孵育容器应密封，创造微好氧至厌氧环境，有利于TTC还原。

　　④ 反应终止与提取：

　　孵育结束后，立即加入甲醇(或丙酮)，剧烈振荡，使生成的红色TF完全溶解到溶剂中。

　　离心或过滤，获取澄清的红色上清液。

　　⑤ 比色测定与计算：

　　用分光光度计在485 nm波长下测定样品组、对照组提取液的吸光度值。

　　用纯TF标准品配制系列浓度溶液，绘制标准曲线(吸光度 vs. TF浓度)。

　　计算公式：

　　脱氢酶活性 = [(As - Ac) × V × n] / (W × t)

　　As：样品组吸光度值(经无基质对照校正后)

　　Ac：灭活对照组吸光度值

　　V：提取液总体积(mL)

　　n：稀释倍数

　　W：烘干土重(g)

　　t：孵育时间(小时)

　　常用单位：μg TF/(g·h) 或 μg TF/(g·24h)

       来源：网络