土壤中芽孢杆菌(Bacillus spp.)的检测是农业、环境微生物学、生物防治及工业菌种筛选中的重要工作。芽孢杆菌是一类革兰氏阳性、产内生孢子、好氧或兼性厌氧的杆状细菌，包括许多有益菌(如枯草芽孢杆菌 B. subtilis、解淀粉芽孢杆菌 B. amyloliquefaciens)和病原菌(如炭疽芽孢杆菌 B. anthracis)。

　　检测方法体系(由简到繁)

　　1. 选择性培养 + 形态鉴定(常规方法)

　　原理：利用芽孢杆菌耐热、耐盐、产芽孢特性进行富集与分离。

　　步骤：

　　样品前处理：

　　取10 g土壤 + 90 mL无菌水，振荡30 min;

　　80℃水浴10–15 min → 杀死营养体，保留芽孢。

　　梯度稀释：10⁻¹ ～ 10⁻⁶

　　涂布选择性培养基：

　　LB琼脂(通用)

　　NA(营养琼脂)

　　MYP琼脂(甘露醇卵黄多粘菌素，用于 B. cereus)

　　PSA(芽孢杆菌选择性琼脂)：含抗生素抑制G⁻菌

　　培养条件：30–37℃，24–48 h

　　典型菌落特征：

　　不透明、粗糙、边缘不齐、易挑起;

　　枯草芽孢杆菌：灰白色，扩散生长;

　　蜡样芽孢杆菌：灰白、毛玻璃状，溶血环(血琼脂)。

　　优点：成本低，可获得活菌用于后续实验

　　缺点：无法区分近缘种，易受杂菌干扰

　　2. 显微镜观察

　　革兰氏染色：阳性(紫色杆状)

　　芽孢染色(如孔雀绿-沙黄法)：

　　芽孢呈绿色，营养体呈红色

　　芽孢位置：中央(枯草)、近端(炭疽)、椭圆膨大(梭菌需排除)

　　注意：梭状芽孢杆菌(Clostridium)为厌氧菌，通常不在好氧培养中生长，可初步排除。

　　3. 生化鉴定

　　常用试验：

　　过氧化氢酶(+)

　　V-P试验(枯草芽孢杆菌 +)

　　硝酸盐还原(多数+)

　　淀粉水解(解淀粉芽孢杆菌强+)

　　商品化系统：API 50CH、Biolog GEN III(自动化)

　　4. 分子生物学方法(精准鉴定)

　　(1)16S rRNA 基因测序 (常用)

　　引物：27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) / 1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)

　　流程：

　　提取土壤总DNA 或 单菌落DNA

　　PCR扩增 → 测序 → BLAST比对(NCBI / EzBioCloud)

　　分辨率：可鉴定到属，部分到种(如枯草 vs 地衣芽孢杆菌需结合其他基因)

　　(2)特异性PCR

　　针对特定种设计引物，如：

　　B. subtilis：gyrA 或 cheA 基因

　　B. cereus group：ces 基因(肠毒素)、hbl、nhe

　　优点：快速、高特异性

　　(3)宏基因组测序(无需培养)

　　直接从土壤DNA分析芽孢杆菌相对丰度

　　适用于复杂群落研究，但成本高

　　5. 定量检测(qPCR)

　　用途：精确测定土壤中某类芽孢杆菌数量(如拷贝数/g 土壤)

　　步骤：

　　提取土壤总DNA

　　设计特异性引物(如针对 B. subtilis 的 spo0A 基因)

　　荧光定量PCR，以标准曲线定量

　　优势：灵敏(可检出10² CFU/g)、快速、不受培养限制

       来源：网络