土壤微生物多样性检测是评估土壤生态健康、功能潜力和生物地球化学循环的关键手段，涵盖细菌、真菌、古菌、原生生物及病毒等类群。检测方法从传统培养到现代分子生物学技术，核心在于揭示微生物群落的组成、结构、功能及其与环境因子的互作关系。以下为常用方法及技术流程：

　　一、检测目标与意义

　　群落组成：物种分类(门、纲、属水平)及丰度分布。

　　多样性指数：α多样性(单样本丰富度、均匀度)、β多样性(样本间差异)。

　　功能基因：参与碳氮循环、抗逆、污染物降解等功能基因的分布。

　　互作网络：微生物间共生、竞争等生态关系。

　　应用场景：农业土壤改良、污染修复、生态恢复评估。

　　二、核心检测技术

　　1. 传统培养法

　　步骤：

　　稀释涂布法：将土壤悬液梯度稀释，涂布于选择性培养基(如细菌LB、真菌PDA)。

　　分离纯化：挑取单菌落，通过形态、生理生化特征初步鉴定。

　　优点：可获得活体菌株，用于功能验证。

　　缺点：仅检测可培养微生物(<1%)，忽略绝大多数不可培养物种。

　　2. 磷脂脂肪酸分析(PLFA)

　　原理：提取微生物细胞膜磷脂脂肪酸，通过GC-MS分析特定标记(如18:2ω6为真菌标志)。

　　步骤：

　　土壤冷冻干燥后，氯仿-甲醇混合液提取脂类。

　　分离磷脂脂肪酸，甲酯化后上机分析。

　　优点：反映活体微生物生物量，快速评估群落结构。

　　缺点：分辨率低(仅到类群水平)，无法区分近缘物种。

　　3. 高通量测序技术

　　技术流程：

　　DNA提取：

　　试剂盒法(如MoBio PowerSoil)裂解细胞，去除腐殖酸干扰。

　　评估DNA质量(Nanodrop A260/A280≈1.8，电泳条带完整)。

　　PCR扩增：

　　靶标区域：

　　细菌/古菌：16S rRNA基因V3-V4区(引物341F/805R)。

　　真菌：ITS1或ITS2区(引物ITS1F/ITS2R)。

　　添加样本特异性Barcode，实现多样本混合测序。

　　测序平台：

　　Illumina NovaSeq(PE250)：高通量、低成本，适合物种组成分析。

　　PacBio SMRT或Oxford Nanopore：长读长测序，提升物种注释精度。

　　生物信息学分析：

　　数据质控：去除低质量序列、嵌合体(USEARCH、QIIME2)。

　　OTU/ASV聚类：97%相似度划分操作分类单元(OTU)或精确序列变体(ASV)。

　　分类注释：比对Silva(细菌)、UNITE(真菌)等数据库。

　　多样性分析：

　　α多样性：Shannon、Chao1、Simpson指数。

　　β多样性：PCoA、NMDS(基于Bray-Curtis距离)。

　　功能预测：PICRUSt2(基于16S数据预测代谢通路)。

　　4. 宏基因组测序(Shotgun Metagenomics)

　　原理：直接对土壤总DNA进行全基因组测序，无需PCR扩增。

　　优势：

　　同时获取物种组成与功能基因信息(如KEGG、COG注释)。

　　检测病毒、质粒等非核糖体标记的微生物。

　　挑战：

　　数据量大，需高性能计算资源。

　　宿主(植物、动物)DNA污染需过滤。

　　5. 定量PCR(qPCR)

　　目的：定量特定功能基因(如nifH固氮基因、amoA氨氧化基因)或病原菌。

　　步骤：

　　设计特异性引物，构建标准曲线(克隆目标基因片段)。

　　实时监测荧光信号，计算基因拷贝数/克土壤。

　　6. 稳定性同位素探针(SIP)

　　原理：利用¹³C/¹⁵N标记底物，追踪参与特定代谢过程的活性微生物。

　　应用：

　　鉴定降解石油烃、农药的功能微生物。

　　关联微生物身份与功能活性。

　　三、实验关键注意事项

　　1. 样本采集与保存

　　采样策略：

　　多点混合取样(避免空间异质性)，记录GPS坐标、植被类型、土层深度(如0-20 cm)。

　　无菌操作，避免交叉污染。

　　保存条件：

　　短期：-20℃(<1周);长期：-80℃或液氮速冻。

　　避免反复冻融(导致DNA降解)。

　　2. 技术选择依据

　　研究目标：

　　物种组成：16S/ITS测序。

　　功能潜力：宏基因组测序。

　　活性功能微生物：SIP或宏转录组。

　　预算与周期：

　　低成本快速筛查：PLFA或16S测序。

　　深度机制解析：宏基因组+代谢组多组学整合。

　　3. 数据质量把控

　　PCR偏差控制：

　　使用高保真酶，限制扩增循环数(≤30)。

　　添加阴性对照(排除试剂污染)。

　　测序深度：

　　细菌：≥50,000 reads/样本(饱和曲线评估)。

　　真菌：≥30,000 reads/样本。

　　4. 数据分析挑战

　　数据库局限性：

　　许多土壤微生物未培养，参考基因组缺失，导致注释率低(可结合de novo分箱)。

　　标准化问题：

　　不同测序平台或引物区域的数据需谨慎比较(建议同一研究内统一方法)。

　　四、前沿技术拓展

　　单细胞测序：

　　分离单个微生物细胞，扩增基因组，突破“不可培养”限制。

　　空间转录组：

　　结合显微成像与测序，解析微生物在土壤团聚体中的空间分布。

　　AI驱动分析：

　　机器学习预测微生物-环境互作网络(如随机森林模型关联pH与菌群结构)。

　　五、应用案例

　　农业管理：对比有机耕作与常规耕作土壤的微生物群落，揭示碳固存潜力。

　　污染修复：通过SIP鉴定石油降解菌，优化生物强化策略。

　　气候变化：研究冻土融化对甲烷菌群落的影响。