β-葡萄糖苷酶是土壤碳循环中的关键酶，它负责催化纤维二糖和其他短链纤维素寡糖水解生成葡萄糖，是纤维素分解的z后一步。因此，其活性是评价土壤碳周转和微生物活性的重要指标。

　　目前常用、经典的方法是以对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(PNG)为底物的比色法。

　　土壤β-葡萄糖苷酶活性测定(对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷法)

　　一、 方法原理

　　利用β-葡萄糖苷酶的专一性，以对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(PNG)作为底物。该底物在β-葡萄糖苷酶的作用下水解，生成对硝基苯酚(PNP) 和葡萄糖。

　　生成的对硝基苯酚(PNP) 在碱性条件下呈黄色，在波长400-410 nm处有z大吸收峰。通过测定反应液中PNP的生成量，即可计算出土壤β-葡萄糖苷酶的活性。

　　反应式：

　　对硝基苯-β-D-葡萄糖苷 (无色) + H₂O —β-葡萄糖苷酶→ 对硝基苯酚 (黄色) + D-葡萄糖

　　二、 实验步骤

　　1. 试剂配制

　　改良通用缓冲液(MUB)， pH 6.0：这是关键，需要精确调节pH。

　　0.05 M 底物溶液：准确称取对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(PNG)，用MUB缓冲液溶解并定容。

　　0.5 M 氢氧化钙溶液 或 0.5 M NaOH 溶液：用于终止反应并使PNP显色。

　　对硝基苯酚(PNP)标准储备液：准确称取高纯度PNP，用蒸馏水溶解，配制成一定浓度(如100 μg/mL)的储备液，用于绘制标准曲线。

　　甲苯：用于抑制土壤杂菌，但现代方法有时会省略。

　　2. 实验设置

　　通常需要设置以下处理，每个处理至少3个重复：

　　样品管(Sample)：土壤 + 缓冲液 + 底物 → 反映总酶活性。

　　土壤对照管(Soil Control)：土壤 + 缓冲液 + 终止液(先加) → 扣除土壤本身颜色。

　　底物对照管(Substrate Control)：无土壤，缓冲液 + 底物 → 扣除底物自分解。

　　标准曲线管(Standard Curve)：用PNP标准液配制一系列浓度梯度。

　　3. 操作流程

　　称样：称取过2mm筛的等效于1.00g烘干土的新鲜土壤于50mL离心管或三角瓶中。

　　预处理：加入0.25 mL甲苯(可选，摇匀放置15分钟)，然后加入4 mL pH 6.0的MUB缓冲液。

　　加底物与孵育：

　　样品管：加入1 mL 0.05 M PNG底物溶液，摇匀。

　　土壤对照管：加入1 mL MUB缓冲液(代替底物)，摇匀。

　　将所有管子密封好，放入37°C恒温培养箱中，精确孵育1小时。

　　终止反应与显色：

　　孵育结束后，立即向样品管和底物对照管中加入1 mL 0.5 M Ca(OH)₂ 或 NaOH 溶液以终止反应并创造碱性环境。

　　土壤对照管在加底物之前就先加入1 mL终止液。

　　过滤/离心：将反应液用慢速定量滤纸过滤，或高速离心(如8000 rpm, 10分钟)，获取清澈的上清液。

　　测定吸光度：用分光光度计在410 nm波长下，以蒸馏水调零，测定所有样品和标准曲线的吸光度值。

　　三、 结果计算

　　绘制标准曲线：

　　以PNP标准品的浓度为横坐标，测得的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程 Y = aX + b(Y为吸光度，X为PNP浓度，μg/mL)。

　　计算样品中PNP的净生成量：

　　样品PNP浓度 (μg/mL) = (As - Asoil - Asub) / a

　　As：样品管的吸光度

　　Asoil：土壤对照管的吸光度

　　Asub：底物对照管的吸光度(通常很小，可忽略)

　　a：标准曲线斜率

　　计算酶活性：

　　酶活性 (μg PNP/g·h) = [PNP浓度 × 反应液总体积] / [土壤干重 × 培养时间]

　　PNP浓度：上一步计算出的值 (μg/mL)

　　反应液总体积：缓冲液4 mL + 底物1 mL + 终止液1 mL = 6 mL

　　土壤干重：换算成烘干土重量 (g)

　　培养时间：1小时 (h)

　　z终单位：通常表示为 μg PNP released per gram of dry soil per hour (μg PNP/g·h)。

　　四、 注意事项与关键点

　　pH值：土壤酶的z近pH不同，必须根据研究目的选择合适的缓冲液pH。pH 6.0是常用条件，但z好根据待测土壤的实际pH进行调整。

　　培养温度与时间：37°C和1小时是标准条件，需精确控制。时间过长可能导致产物抑制或非线性反应。

　　土壤储存：z好使用新鲜土壤进行测定。如需储存，应在4°C下短期保存，或-20°C及以下长期冷冻，但冷冻可能会对部分酶活性产生影响。

　　基质浓度：确保底物浓度在反应中处于饱和水平，使反应速度达到z大(Vmax)，这样测得的才是“潜在酶活性”。

　　无菌操作：甲苯的作用是抑制微生物生长，防止其在孵育期间消耗产物或产生新的酶。现代研究为了更贴近原位情况，有时会省略甲苯。

　　质量控制：每次测定都必须带标准曲线和各类对照，以确保数据的准确性。

　　五、 方法来源与引用

　　此方法主要基于经典土壤酶学方法：

　　Tabatabai, M. A. (1994). Soil Enzymes. In Methods of Soil Analysis: Part 2 Microbiological and Biochemical Properties (pp. 775-833). SSSA Book Series No. 5.

　　Eivazi, F., & Tabatabai, M. A. (1988). Glucosidases and galactosidases in soils. Soil Biology and Biochemistry, 20(5), 601-606.

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