土壤真菌测序分析是利用高通量测序技术(如 Illumina MiSeq/Novaseq)对土壤中真菌群落的物种组成、多样性、功能潜力及生态响应进行系统解析的现代微生物生态学方法。该技术广泛应用于农业可持续管理、污染修复、森林生态、病害预警及全球变化研究等领域。

　　第一阶段：湿实验

　　样本采集与保存：

　　代表性：多点混合取样，避免偶然性。

　　无菌操作：防止交叉污染。

　　快速处理：立即放入液氮或-80℃冰箱，或使用专用土壤DNA保存液，抑制DNA降解。

　　土壤总DNA提取：

　　挑战：土壤成分复杂(腐殖酸、重金属等)会抑制后续PCR和测序。

　　方法：使用商业化的土壤DNA提取试剂盒，确保DNA产量高、纯度好、片段完整。

　　PCR扩增与建库：

　　引物选择：使用真菌特异性引物扩增ITS1或ITS2区域(如ITS1F/ITS2， ITS3/ITS4)。

　　添加标签：在引物上添加独特的Barcode序列，以便将混合测序的数据区分回各自的样本。

　　质量控制：对PCR产物进行电泳和定量。

　　第二阶段：生物信息学分析(核心)

　　原始数据处理：

　　质量过滤：去除低质量、含N碱基、接头污染的序列。

　　拼接与去噪：将双端序列拼接成一条，并通过算法(如DADA2, UNOISE3)校正测序错误，生成精确的 ASV。

　　ASV：扩增子序列变异，是分析的基本单位，比传统的OTU分辨率更高、更精确。

　　物种注释：

　　数据库比对：将ASV序列与参考数据库(如 UNITE, SILVA, NCBI-nt)进行比对。

　　获得分类学信息：确定每个ASV所属的 界-门-纲-目-科-属-种。

　　难点：真菌数据库仍不完善，许多环境序列只能注释到“属”或更高的分类等级。

　　多样性分析：

　　α多样性：衡量单个样本内部的真菌多样性。

　　指数：Chao1(丰富度)、Shannon(多样性)、Simpson(优势度)。

　　β多样性：比较不同样本间群落组成的差异。

　　方法：基于距离矩阵(如Bray-Curtis距离、UniFrac距离)进行PCoA、NMDS等排序分析，直观展示样本聚类情况。

　　统计分析：

　　差异物种检验：使用LEfSe、ANCOM等算法，找出在不同处理组间(如施肥 vs 不施肥)具有显著差异的真菌类群。

　　关联网络分析：构建真菌共现网络，揭示物种间的潜在互作关系(共生、竞争)。

　　环境因子关联：将群落数据与土壤pH、有机碳、氮磷含量等环境变量结合，进行RDA/CCA分析或Mantel检验，找出驱动真菌群落变化的关键因子。

　　功能预测：

　　工具：使用 FUNGuild、 FAPROTAX(针对真菌)等工具，根据已注释的真菌分类信息，推测其可能的功能(如植物病原、腐生、菌根共生等)。

       来源：网络