土壤多酚氧化酶活性测定主要通过邻苯三酚比色法，利用紫外分光光度计测定反应产物的吸光度来量化酶活性。

　　所需试剂与仪器

　　试剂：

　　0.5% 邻苯二酚溶液：用 pH 5.0 的缓冲液配制(现用现配，避免氧化)。

　　pH 5.0 磷酸盐缓冲液(或乙酸-乙酸钠缓冲液)。

　　乙醚或丙酮：用于终止反应。

　　石英砂(或无酶活性的纯砂)：作为对照和调节用。

　　仪器：

　　恒温培养箱或水浴锅

　　分光光度计

　　离心机与离心管

　　摇床或振荡器

　　移液器、定时器

　　操作流程

　　1. 样品准备

　　取过2 mm筛的新鲜土壤样品(风干土也可，但新鲜土更能反映真实活性)。

　　精确称取 2.00 g 土样于多个50 mL离心管或三角瓶中。

　　2. 设置实验组(每个样品建议设3个重复)

　　处理组(样品组)：土壤 + 缓冲液 + 邻苯二酚溶液

　　土壤对照：土壤 + 缓冲液 + 等量水(代替底物，用于扣除土壤本身的颜色)

　　无土对照：缓冲液 + 邻苯二酚溶液(用于检验试剂纯度和非酶促氧化)

　　3. 酶促反应

　　向所有试管中加入一定量(如5 mL)的 pH 5.0 缓冲液。

　　向处理组和无土对照中加入一定量(如2 mL)的 0.5% 邻苯二酚溶液。

　　向土壤对照中加入等体积的去离子水。

　　立即充分摇匀，塞紧瓶塞。

　　置于 30°C 恒温培养箱中精确培养 2 小时。

　　4. 反应终止与提取

　　培养结束后，立即取出所有试管。

　　迅速加入 10 mL 乙醚(或丙酮)，并剧烈振荡，以终止酶反应并提取生成的棕红色醌类物质。

　　进行 离心(如 4000 rpm, 10 分钟)，取上层的有机相(乙醚提取液)进行比色测定。

　　5. 比色测定

　　用分光光度计，在 430 nm 波长下，以乙醚(或土壤对照组的提取液)作为参比调零。

　　测定处理组和无土对照组提取液的吸光度值。

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